SuperFcs條件性恐懼實(shí)驗(yàn)方法案例以及注意事項(xiàng)

                                                ----毛冬青改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶作用的研究

摘要：目的觀察毛冬青提取物（pubescent holly root extract，PHRE）對血管性癡呆（VD）模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討其潛在的作用機(jī)制。方法采用反復(fù)夾閉、再通雙側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)尾靜脈放血的方法制備小鼠癡呆模型，隨后將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，尼莫地平對照組（30 mg·kg-1），毛冬青低、中、高劑量組（5，10，20 g·kg-1），各組灌胃相應(yīng)**10 mL·kg-1，連續(xù)35 d，從第30 天開始進(jìn)行行為學(xué)檢測，末次給藥后收集大腦樣本，HE 染色觀察病理學(xué)變化、**組化法及Western Blot 法檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的恐懼記憶時(shí)間明顯縮短，大腦海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞病變嚴(yán)重，海馬區(qū)Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)的比值降低，且主要分布于胞質(zhì)。與模型組比較，各**組小鼠的恐懼記憶時(shí)間明顯延長，大腦海馬區(qū)的組織病變情況改善，且海馬區(qū)Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)的比值顯著增加。結(jié)論毛冬青提取物可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，從而改善血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

關(guān)鍵詞：毛冬青提取物；血管性癡呆；學(xué)習(xí)記憶能力；細(xì)胞凋亡

隨著全球老齡化的出現(xiàn)，慢性**癡呆越來越引起人們的關(guān)注。其中，血管性癡呆（vasculardementia，VD）是繼阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）之后誘發(fā)老年期癡呆的**大病因，也是目前**可以預(yù)防的腦退化**類型。因此，研發(fā)有效預(yù)防及**VD 的**具有重要的意義。毛冬青為冬青科冬青屬植物毛冬青（Ilex pubescens Hook .et Arn）的干燥根或葉，是我國南方常用中藥，具有****、消腫止痛、****等功效，大量研究表明，毛冬青的各類制劑對冠心病、腦血栓、血栓性脈管炎等心腦血管**均有顯著療效。本研究通過觀察毛冬青提取物（pubescent holly root extract， PHRE）對血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬區(qū)病理變化及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討毛冬青改善血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶的可能作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治VD 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物KM 種小鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量32～35 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（粵）2013-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境：溫度23～25 ℃；相對濕度（50±5）%，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。1.2 **及主要試劑毛冬青飲片分別購于康美藥業(yè)股份有限公司和廣州大翔藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青飲片300g，粉碎成粗粉，加入60 %乙醇加熱回流提取2 次，依次用6 倍量和4 倍量溶媒分別提取1.5 h 和1 h，濾過后合并藥液，減壓濃縮至150 mL，即得PHRE 儲(chǔ)備液，用時(shí)以蒸餾水稀釋至所需濃度。

尼莫地平片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：BJ24208。SABC **組化染色試劑盒，博士德生物，批號： 11C29C。β-actin 抗體， bioworld， 批號：AP0060。Bcl-2 抗體，abcam，批號：ab182858。Bax抗體，abcam，批號：ab32503。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：IH-0011。

1.3儀器AUM220D 電子分析天平，日本Shimadzu公司；超低溫冰箱，美國Thermo 公司；制冰機(jī)，日本Sanyo 公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，中國中科中佳科技儀器有限公司； 多功能酶標(biāo)儀， 美國PerkinElmer 公司；CM1950 冰凍切片機(jī)，ASP200S 脫水機(jī)，EG1160 包埋機(jī)，RM2135 切片機(jī)，ST5020 染色機(jī)，DC300 光學(xué)顯微鏡，均為德國Leica 公司；小鼠條件恐懼試箱、XR-XC404 條件性恐懼分析系統(tǒng)，上海欣軟科技有限公司。

1.4 分組、模型制備及給藥取雄性KM 種小鼠，采用頸總動(dòng)脈結(jié)扎反復(fù)缺血再灌注的方法[5]制備經(jīng)典VD 模型：小鼠腹腔注射3.5 %水合氯醛（10 mL·kg-1）全身麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾阻斷其血流30 min，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流10 min，重復(fù)3 次。于第1 次阻斷血流5 min 后， 小鼠斷尾放血約0.3 mL，冷凝止血。第3 次血流再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈同等時(shí)間即可縫合皮膚。造模后第2 天，除假手術(shù)組外，將模型小鼠隨機(jī)分為5 組，分別為模型組，尼莫地平對照組（30 mg·kg-1），PHRE 低、中、高劑量組（含生藥量5，10，20 g·kg-1），每組12 只。各組小鼠按10 mL·kg-1灌胃給藥，連續(xù)35 d，每天1 次，假手術(shù)組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

1.5 行為學(xué)檢測

1.5.1爬桿實(shí)驗(yàn)第30 天給藥后2 h，進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)測試。將一根長50 cm、粗1.5 cm 的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用紗布包裹以防打滑，小鼠頭朝下放置于竹竿頂部，記錄小鼠爬完桿長全長所需時(shí)間。正式記錄評分之前，訓(xùn)練小鼠爬桿3 d，每日1 次，確保每只小鼠學(xué)會(huì)爬桿。根據(jù)爬桿時(shí)間進(jìn)行評分，若小鼠墜落評7 分，不動(dòng)評6 分，40 s 掉頭評5 分，20 s 掉頭評4 分，爬完全長31～40 s 者評3 分，21～30 s 者評2 分，11～20 s 者評1 分，0～11 s 者評0 分。

1.5.2條件恐懼實(shí)驗(yàn)給藥34 d 后進(jìn)行條件恐懼實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，**階段為恐懼訓(xùn)練階段，即第34 天給藥2 h 后，將小鼠放入恐懼箱中，從20 s 開始給予聲刺激（75 dB，2000 Hz），持續(xù)10 s，從25 s 開始給予光刺激，持續(xù)5 s，從28 s 開始足部電刺激（0.8 mA）2 s。共進(jìn)行4 個(gè)循環(huán)，間隔時(shí)間各為15 s。**階段為測試階段，即第35 天給藥2 h 后，將小鼠放入恐懼箱中，場景與受訓(xùn)階段場景一致，提供相同的聲、光等提示性信號，但不給予電擊，動(dòng)物仍將會(huì)表現(xiàn)出恐懼反應(yīng)，通過觀察動(dòng)物的僵直時(shí)間來反映動(dòng)物對恐懼的記憶能力。

1.6樣本采集恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)束2 h 后，每組隨機(jī)選取6 只小鼠，腹腔注射3.5 %水合氯醛（10 mL·kg-1）麻醉，通過心臟灌注4 %多聚甲醛固定腦組織，灌注完成后，取腦組織置于10 %中性福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠斷頭處死，迅速摘取大腦，分離海馬區(qū)，用于**組化及Western Blot 檢測。

1.7 HE 染色觀察固定好的腦組織經(jīng)修整、脫水、包埋、切片、HE 染色、封片等程序后，使用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠海馬組織CA1 區(qū)組織結(jié)構(gòu)的變化。1.8 **組化檢測Bcl-2、Bax蛋白的分布及表達(dá)用Tissue OCT-Freeze Medium 包埋小鼠大腦并制作冰凍切片。嚴(yán)格按照SABC **組化染色試劑盒說明依次固定、封閉、一抗孵育、二抗孵育、SABC 孵育、DAB 顯色、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，并用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)碼照相及圖片分析Bcl-2、Bax 蛋白的分布及表達(dá)情況。

1.9 Western Blot 法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)分離小鼠大腦海馬區(qū)組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行定量。取50 μg 蛋白樣本，用15 %的聚丙烯酰氨凝膠進(jìn)行電泳80 V、20 min，之后轉(zhuǎn)換為120V、80 min；然后采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜300 mA、1 h；TBST 洗膜10 min，3 次；5 % BSA 常溫封閉4 h；4 ℃孵育一抗過夜；TBST 洗膜10 min，3 次；37 ℃孵育二抗1 h；TBST 洗膜10 min，3 次；ECL 進(jìn)行發(fā)光，用Image Lab 3.0 軟件對Western Blot 成像圖進(jìn)行分析，計(jì)算各組蛋白與內(nèi)參（β-actin）的相對表達(dá)值。1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者使用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊者使用Dunnett’s 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠爬桿評分比較爬桿實(shí)驗(yàn)用于評價(jià)各組間小鼠肢體協(xié)調(diào)能力的差異。評分結(jié)果顯示：假手術(shù)組、模型組及各給藥組間均無明顯差異（P＞0.05），表明本研究采用的VD 造模方法對小鼠的運(yùn)動(dòng)及平衡能力沒有造成影響。

2.2 PHRE 對小鼠條件恐懼記憶的影響與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的僵直時(shí)間百分比顯著縮短（P＜0.05），表明VD 模型復(fù)制成功，小鼠的記憶能力下降。與模型組比較，尼莫地平組及PHRE 中、高劑量組小鼠的僵直時(shí)間百分比明顯延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明PHRE 在10~20 g·kg-1范圍內(nèi)對VD 小鼠的記憶能力有明顯的改善作用。

2.3 毛冬青提取物對VD 小鼠大腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響病理組織學(xué)檢查顯示，假手術(shù)組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)及分布未見異常。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞間質(zhì)水腫，細(xì)胞核濃染、固縮，皮層神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，且伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生，多處聚集成堆，大腦海馬CA1 區(qū)的錐體細(xì)胞大量缺失、變性、壞死，齒狀回顆粒細(xì)胞變性成空泡樣。與模型組比較，PHRE 低、中、高劑量組和尼莫地平組小鼠的大腦神經(jīng)元病變情況有明顯改善，體現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生減少，海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞病變程度明顯減輕。

2.4 **組化法檢測VD 小鼠海馬CA1 區(qū)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的分布和表達(dá)結(jié)果顯示，Bcl-2 和Bax呈不連續(xù)的環(huán)狀或者片狀分布，主要在胞質(zhì)表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組的Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)明顯增加。與模型組比較，尼莫地平組及PHRE 中、高劑量組的Bcl-2 表達(dá)增加，Bax 表達(dá)減少。表明VD 模型小鼠的海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在尼莫地平或PHRE 的干預(yù)下，凋亡現(xiàn)象減少，提示毛冬青提取物可以減少VD 模型小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

2.5 Western Blot 法檢測VD 小鼠海馬區(qū)Bcl -2、Bax蛋白的表達(dá)Bcl-2 水平的升高和Bax 蛋白的降低表明細(xì)胞對凋亡的抵抗性增強(qiáng)，是**起保護(hù)作用的標(biāo)志。Bcl-2/Bax 的比值越大，則抗凋亡能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，與模型組比較，毛冬青提取物能提高VD 小鼠海馬區(qū)Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)降低Bax 蛋白的表達(dá)，即明顯升高Bcl-2/Bax 的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD 小鼠海馬區(qū)細(xì)胞的抗凋亡能力，從而對VD 小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元起保護(hù)作用。

3 討論

本研究通過血流阻斷聯(lián)合放血法復(fù)制小鼠VD 模型，經(jīng)過小鼠智能測試及病理學(xué)檢查證實(shí)模型制備成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VD 模型組小鼠恐懼記憶時(shí)間縮短，且腦部海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元發(fā)生損傷，而毛冬青提取物能夠明顯提高VD 小鼠的恐懼記憶時(shí)間，降低VD 小鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷的程度，結(jié)合其對凋亡蛋白Bcl-2/Bax 的影響可以推斷，毛冬青通過抑制海馬CA1 區(qū)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

大腦海馬區(qū)損傷會(huì)引起血管性癡呆，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。海馬體與大腦記憶有關(guān)，并且對腦缺血敏感[10]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海馬CA1 區(qū)椎體神經(jīng)元細(xì)胞的死亡會(huì)引起嚙齒類、靈長類動(dòng)物以及人類出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[11-12]。因此，海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞對學(xué)習(xí)和記憶能力至關(guān)重要，然而CA1 區(qū)對腦缺血尤為敏感，會(huì)引起嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶功能退化。病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VD 模型組小鼠的大腦海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞大量缺失、變性、壞死，并且齒狀回顆粒細(xì)胞變性成空泡樣。毛冬青提取物可阻止CA1 區(qū)錐體細(xì)胞缺失，從而起到保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，改善VD 小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。

細(xì)胞凋亡在缺血再灌注損傷中具有重要的作用。Bcl-2 和Bax 屬于Bcl-2 家族蛋白，調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bcl-2 屬于抑凋亡蛋白，可以阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿。Bax 屬于促凋亡蛋白，通過移位到線粒體膜上促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放。Bcl-2 通過平衡Bcl-2/Bax 維持線粒體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬區(qū)Bcl-2 與Bax 蛋白表達(dá)均有所升高，可能為小鼠大腦間斷缺血后，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于細(xì)胞自身的保護(hù)機(jī)制，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)反應(yīng)性上調(diào)，發(fā)揮抑制凋亡的作用。由于Bcl-2/Bax 的比例決定細(xì)胞在受到凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡，在VD 小鼠模型中，Bax 蛋白的表達(dá)占優(yōu)勢，從而導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，海馬區(qū)形態(tài)受損，記憶力出現(xiàn)障礙；與模型組比較，毛冬青提取物能夠提高Bcl-2 的表達(dá)，降低Bax 的表達(dá)，從而顯著提高Bcl-2/Bax 的比值，使海馬CA1 區(qū)細(xì)胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通過調(diào)節(jié)海馬CA1 區(qū)Bcl-2、Bax 的表達(dá)，抑制CA1 區(qū)的細(xì)胞凋亡，從而改善VD 模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

毛冬青已被廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)**的**，療效確切。近年來，也有學(xué)者深入探討毛冬青對腦損傷的保護(hù)作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛冬青提取物在高劑量時(shí)，改善VD 小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的效果與尼莫地平相似，可通過抑制VD 模型小鼠的腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡來提高學(xué)習(xí)記憶能力，有望發(fā)展成為一種新的**血管性癡呆**。