［摘 要］ 目的: 探討心理應激狀態(tài)下咬**覺敏感增高現(xiàn)象與三叉神經脊束核尾側亞核( Vc) 內星形膠質細胞活化的關系。方法: 健康雄性 SD 大鼠40 只，隨機分為: 空白對照組和應激3、7、14 d 組( n =10) ，實驗組大鼠經束縛應激相應時間后，采用曠場實驗和高架十字迷宮實驗觀察各組大鼠焦慮、抑郁樣情緒; VonFrey 絲刺激檢測各組大鼠咬肌的機械性痛閾; **組化染色和 Western－blot 檢測 Vc 內星形膠質細胞活化標志物神經膠質酸性蛋白( GFAP) 表達的變化。結果: ①束縛應激 7、14 d 組大鼠在曠場中央停留時間和中央活動總路程，以及在高架十字迷宮開放臂中的滯留時間百分比和進入開放臂次數(shù)百分比均較空白對照組明顯降低( P ＜0． 05) ; ②束縛應激 7、14 d 組大鼠咬肌機械性痛閾均較空白對照組明顯降低( P ＜ 0． 05) ; ③束縛應激 7、14 d 組大鼠 Vc 內 GFAP 的表達陽性率及其蛋白的表達水平均明顯高于空白對照組( P ＜ 0． 05) 。結論: 慢性束縛造成的心理應激能導致 Vc 內星形膠質細胞的活化，可能參與了心理應激導致的咬**覺敏感性的增高。
［關鍵詞］心理應激; 痛覺敏感; 三叉神經脊束核尾側亞核; 星形膠質細胞; GFAP
頜面部咀嚼肌疼痛是顳下頜關節(jié)紊亂病*常見的癥狀之一，與精神心理因素有著密切的關系，本課題組前期研究表明心理應激能夠導致大鼠咀嚼**覺敏感性增高。近年來的研究顯示，延髓的三叉神經脊束核尾側亞核( Vc)既是頜面部信息整合的關鍵核團，又是痛覺信息向**傳導的**門戶，而**神經系統(tǒng)的星形膠質細胞參與了多種類型的疼痛，并與疼痛的惡化和維持密切相關。那么，Vc 內的星形膠質細胞在心理應激致咀嚼**覺敏感的過程中起怎樣作用，目前尚不清楚。因此，本實驗擬在前期研究基礎上，觀察星形膠質細胞在心理應激所致咀嚼肌疼痛過程中的表達，為進一步探討心理應激后口頜面疼痛的**機制奠定實驗基礎。
1 材料和方法
1． 1 主要材料和設備
雄性 Sprague－Dawley 大鼠( 第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供) ; 自制束縛器; XR-XZ301曠場實驗箱、XR-XG201高架十字迷宮 ( 上海欣軟信息科技有限公司) ; BCA 蛋白定量試劑盒( 上海西唐生物科技有限公司) ; 鼠單抗 GFAP、DAB 顯色劑、ECL 發(fā)光液( Abcam 公司，英國) ; 發(fā)光儀( Bio－Ｒad公司，美國) 。
1． 2 心理應激動物模型的建立
取體質量( 200 ～220) g SD 大鼠 40 只，隨機分為 1 個空白對照組和束縛應激 3、7、14 d 3 個實驗組，每組 10 只。然后參照文獻報道的方法對 3個實驗組大鼠分別進行束縛應激處理 3、7、14 d，每天9 ∶ 00 ～17 ∶ 00 共8 h，應激期間大鼠禁食禁水; 空白對照組大鼠不做任何處理。整個實驗期間所有大鼠均在室溫( 22 ±2) ℃條件下進行飼養(yǎng)，每天光照 12 h，自由飲水、進食。
1． 3 行為學測試
應激結束后分別采用曠場實驗和高架十字迷宮實驗對各組大鼠的行為學進行測試。每組實驗完成后均徹底清理實驗箱，并噴灑 750 mL/L 乙醇以消除大鼠殘留的氣味。
曠場實驗和高架十字迷宮實驗是評價大鼠**腦功能的重要實驗。正常情況下，大鼠多傾向于沿著曠場的邊緣活動，但由于好奇心的驅使，大鼠又會向曠場中央進行探索; 同樣在高架十字迷宮實驗中，大鼠趨向于躲避在閉合臂，但也有向開放臂探索的情況。大鼠在曠場中央停留時間減少或進入開臂次數(shù)減少或在開臂滯留時間縮短，即表明其出現(xiàn)了抑郁、焦慮等行為學異常的表現(xiàn)。
1． 3． 1 曠場實驗 ( Open field test)
分別于實驗第 3、7、14 d 取各組大鼠放置于曠場實驗箱( 規(guī)格為 100 cm ×100 cm × 80 cm) 的隔音房內，并用弱光照明; 待大鼠適應環(huán)境 5 min 后，將其放入曠場中央，記錄 15 min 內每只大鼠在中央停留的時間( s) 、總路程( cm) 。
1． 3． 2 高架十字迷宮實驗( Elevated plus maze text)
待大鼠適應環(huán)境 5 min 后，將其放入“十”字狀的中央并使面向閉合臂，記錄 5 min 內每只大鼠進入開放臂和閉合臂的次數(shù)以及停留時間。所得結果以每只大鼠在開放臂滯留時間的百分比( %) 和進入開放臂次數(shù)的百分比( %) 表示。
1． 4 痛覺敏感度測定
分別于束縛應激前( 作為基線) 和束縛應激后1、3、7、14 d 各時間點，取空白對照組和各實驗組大鼠，使用 Von Frey 纖維絲從細到粗依次對各大鼠的咬肌進行刺激; 每一型號刺激 5 次，當動物出現(xiàn)至少 3 次縮頭、避開、抬腿、發(fā)出聲音等行為時，即視為有痛覺反應，并以該 Von Frey 纖維絲對應的壓力值作為該動物的痛覺閾值。痛覺閾值降低，即說明其痛覺敏感度升高。
1． 5 心理應激對 GFAP 表達影響的觀察
1． 5． 1 **組化染色檢測 GFAP 的表達水平
上述檢測結束后，取各組大鼠分別在 10 g/L****鈉過量麻醉( 50 mg/kg 腹腔注射) 下，用0． 1 mol / L 磷酸鹽緩沖溶液( PBS) 經左心室快速灌注，沖凈血液后換用 4 ℃ 的 40 g/L 多聚甲醛溶液 300 mL 進行灌注固定; 然后取各大鼠的腦干及頸髓，并以閂門平面為中心切取包括頭向 4 mm、尾向6 mm 的組織塊，放入 40 g/L 多聚甲醛液中 4 ℃下固定 4 ～6 h 后，再置于 300 g/L 蔗糖液中 4 ℃過夜。取固定后的各組織塊，分別進行橫向連續(xù)冰凍切片( 厚 25 μm) 。取各組切片放入 0． 1 mol/L PBS中置搖床上漂洗3 次( 每次10 min) 后，滴加驢血清封閉 10 min; 滴加鼠抗 GFAP( 1 ∶ 700) 一抗，室溫、慢搖 24 h; 滴加驢抗鼠 ( 1 ∶ 500) 二抗，室溫、慢搖4 h，*后再滴加 AB 液 ( 1 ∶ 500 ) ，室溫、慢搖 1 h。以上每個步驟完成后均用 PBS 漂洗 3 次，每次10 min。取上述處理的所有切片，分別進行 DAB顯色后，脫水、透明，中性樹膠封片; 顯微鏡下觀察并用計算機輔助成像分析裝置檢測各組相同部位星形膠質細胞的**陽性率( percent area occupiedby immuno—products( % ) )。
1． 5． 2 Western－blot 檢測 GFAP 蛋白的表達水平
斷頭處死各組大鼠，分別取其三叉神經脊束核尾側亞核，冰上孵育 10 min 后轉移至 1． 5 mL 的離心管中，超聲粉碎( 500 W) 5 s × 5 次; 10 000 r/min離心5 min，取上清并用 BCA 蛋白定量法測定總蛋白濃度。制備 12% 的分離膠和 4% 濃縮膠，然后取總蛋白以每孔20 μg 上樣進行 SDS． PAGE 電泳( 濃縮膠80 V，分離膠 120V) 。電泳結束后，取適當大小的凝膠和 PVDF 膜在50 V 電壓下轉膜，并用麗春紅染色觀察轉膜效果; 然后將 PVDF 膜置于50 g/L去脂奶粉中封閉2 h; 依次加入一抗 ( 1∶1000) 、二抗( 1∶1 000) 雜交，室溫下振蕩封閉; 化學發(fā)光顯色，并用 Quantity One 4．4 軟件對圖像進行分析。以目的條帶與內參 β－actin 條帶的灰度值之比作為該樣本中 GFAP 蛋白的相對表達量。
1． 6 統(tǒng)計學分析
采用 SPSS 13． 0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)( x珋 ± s) 進行one－way ANOVA 分析，兩兩比較用 SNK－q 檢驗; 疼痛閾值與 GFAP 活化水平的相關性采用 Pearson 相關分析，檢驗水準 α =0． 05。
2 結果
2． 1 行為學分析結果
2． 1． 1 曠場實驗
隨著心理應激時間的延長，大鼠曠場實驗中的兩指標均呈下降趨勢。其中應激 7、14 d 組大鼠的中央停留時間與空白對照組相比均顯著降低( P ＜0． 05) ( 圖 1) ; 而應激 14 d 組大鼠的活動總路程與空白對照組相比明顯降低( P ＜0． 05) ( 圖 2) 。
2． 1． 2 高架十字迷宮實驗
隨著心理應激時間的延長，大鼠高架十字迷宮實驗中的兩指標均呈下降趨勢。其中，應激 14 d組大鼠的開臂滯留時間百分比與空白對照組相比顯著降低( P ＜0． 05) ( 圖 3) ; 應激 7 d 組、14 d 組大鼠進入開臂次數(shù)百分比與空白對照組相比均顯著
降低( P ＜0． 05) ( 圖 4) 。
2． 2 機械性痛閾測定結果
Von Frey 纖維絲痛閾測定結果顯示，隨著應激時間的延長，大鼠咬肌疼痛閾值呈降低趨勢。其中應激 7、14 d 組大鼠的咬**覺閾值與空白對照組相比均顯著降低( P ＜0． 05) ( 圖 5) 。
2． 3 心理應激對 GFAP 表達的影響
2． 3． 1 **組化觀察結果
**組化染色結果顯示，空白對照組僅可見少量而散在分布的 GFAP 陽性細胞; 而應激不同時間后，GFAP 陽性細胞數(shù)均有所上升( 圖 6) ，且隨著應激時間的延長上升越來越明顯; 其中應激 7 d 組和應激 14 d 組與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義( P ＜0． 05) ( 圖 7) 。
2． 3． 2 Western－blot 檢測結果Western－blot 結果顯示，心理應激后 GFAP 蛋
白的表達量在應激 7 d 和 14 d 組中有所升高，分別與空白對照組相比均有統(tǒng)計學差異( P ＜ 0． 05)。圖 8
2． 4 疼痛閾值與 GFAP 活化水平的相關性分析
Pearson 相關分析結果顯示，大鼠咬肌的疼痛閾值與 Vc 內 GFAP **組化染色陽性率以及GFAP western － blot 相 對 灰 度 值 均 呈 負 相 關( P ＜0． 05) ( 表 1) 。
3 討論
束縛應激是一種能引起典型非特異應激表現(xiàn)的方法，該方法不僅可通過限制動物的活動自由而使之產生應激，同時還能將應激過程對軀體的創(chuàng)傷性減小到*低。因此，為避免創(chuàng)傷性應激，本實驗采用束縛應激的方法建立心理應激動物模型。行為學測試顯示，大鼠受到束縛應激之后，在曠場中央?yún)^(qū)的停留時間、總路程以及進入高架十字開臂的次數(shù)和停留時間等均隨應激時間的延長而呈下降趨勢，表明大鼠出現(xiàn)了顯著的焦慮抑郁樣負性情緒; 并提示模型建立成功。
心理應激是機體在某種環(huán)境刺激作用下，由于客觀要求和應對能力不平衡所產生的一種緊張性反應。當今社會，面對日趨復雜和激烈的社會競爭，人們往往容易產生心理應激，而心理應激又與頜面部疼痛，尤其是口頜肌的疼痛有較大相關性。Diniz 等對 55 所中學即將高考的學生進行調查發(fā)現(xiàn)，約有 50． 9%的人出現(xiàn)顳頜關節(jié)彈響、頜面部疼痛等與顳頜關節(jié)功能紊亂病相關的癥狀。另有研究發(fā)現(xiàn)，心理應激還可引起口頜肌肌電活動增加、肌緊張度升高、肌疼痛敏感度增強等。本實驗應用慢性束縛的方法成功建立了大鼠心理應激模型，并觀察到，應激 7 d 和 14 d 組大鼠咬肌機械性痛閾值明顯下降( 疼痛敏感度明顯升高) ，與本課題組前期的研究結果一致。
三叉神經脊束核 ( spinal trigeminal nucleus，STN，包括口側亞核 Vo、極間亞核 Vi、尾側亞核Vc) 是頜面部信息向**傳導的**門戶，是參與口頜面部傷害性信息傳遞的重要部位。Sara等研究發(fā)現(xiàn)，心理應激可使大鼠 Vc 內的磷酸化環(huán)磷酯腺苷( cAMP) 反應成分結合蛋白( pCＲEB) 及其下游基因轉錄上調，故 Vc 被認為是心理應激引起疼痛的**關鍵部位。有研究證明，舌下注射福爾馬林引起炎性舌**后，在 Vc 內可觀察到星形膠質細胞活化。Kohei 等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠咬肌注射完全弗氏佐劑( CFA) 后，Vc 中星形膠質細胞活化的特異性標志物 GFAP 表達量增加。除上述炎性痛外，近年來還有研究證實，通過結扎大鼠 L5 脊神經使之產生神經病理性痛時，其脊髓背角星形膠質細胞也出現(xiàn)明顯活化。上述結果提示，無論在炎性痛還是神經病理性痛情況下，星形膠質細胞都會出現(xiàn)明顯的活化，且與痛覺敏感度密切相關。本實驗也觀察到，大鼠經慢性束縛應激后，其 Vc 內的星形膠質細胞明顯活化，且呈現(xiàn)出慢性化過程并與咬肌的痛覺敏感度相關聯(lián)。
星形膠質細胞活化參與疼痛的維持可能與星形膠質細胞 － 神經元交互作用( crosstalk) 有關。有研究報道，星形膠質細胞活化后可釋放各種炎性細胞因子，如白細胞介素 1( IL －1) 、白細胞介素 6( IL －6) 、腫瘤壞死因子( TNF － α) 等，從而導致神經炎癥反應，并進而使之惡化和維持疼痛。汪偉等研究發(fā)現(xiàn)，當出現(xiàn)神經病理性痛時，脊髓背角 GFAP 與 c－jun N 末端激酶( pJNK) 大量共存，小膠質細胞活化標志物 CD11b 與 pp38 大量共存，且各自的表達均具有時空特異性，即小膠質細胞在神經損傷后數(shù)小時達到峰值，此后逐漸降低; 而星形膠質細胞則在神經損傷后數(shù)日至數(shù)周才逐漸活化并持續(xù)表達，提示小膠質細胞在疼痛的發(fā)生中起重要作用，星形膠質細胞在疼痛的維持和惡化階段扮演重要角色。本實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠 Vc 內GFAP 的表達在建模 7 d 后明顯升高，且至少持續(xù)至 2 周，與上述結果相類似; 進一步說明星形膠質細胞可能參與介導了大鼠咬**敏的持續(xù)存在。
本課題組前期的研究主要集中于心理應激后的外周水平，并觀察到大鼠經心理應激后其下丘腦 － 垂體 － 腎上腺皮質軸興奮性增強; 三叉神經節(jié)內降鈣素基因相關肽( CGＲP) mＲNA 的表達水平增加。以上結果提示，來自初級傳入的肽能纖維可能在 Vc 內釋放增加并進而激活**，即外周敏化引起**敏化; 而在此過程中位于 Vc 的星形膠質細胞可能發(fā)揮著重要的作用。
本結果提示，Vc 可能是調控心理應激導致口頜面部疼痛的主要區(qū)域，而且 Vc 內 GFAP 的活化可能參與了心理應激后痛覺過敏的發(fā)生; 但星形膠質細胞的激活或抑制是否能直接影響心理應激后痛覺敏感的發(fā)生仍需要進一步的研究。
